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    公开号:WO1992001053A1
    申请号:PCT/JP1991/000942
    申请日:1991-07-15
    公开日:1992-01-23
    发明作者:Nobuyuki Shima；Kanji Higashio；Masaya Nagao；Fumiko Oogaki；Hiroaki Takaoka；Eisuke Tsuda
    申请人:Snow Brand Milk Products Co., Ltd.；
    IPC主号:C07K14-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書
    [0002] TCF - Πのア ミ ノ駿配列をコー ドする DN A を含むプラス ミ ド 形質転換細胞及びこれを用いて生理活性物質を生産する方法 技 術 分 野
    [0003] 本発明は、 ヒ ト線維芽細胞由来の新規な糖蛋白踅 （以下、 TCF- Π という ） のア ミ ノ酸配列をコー ドする DN.A を舍むプラ ス ミ ド、 こ のプラ ス ミ ドで形質転換した細胞及びこ の形質転 換体を用いて生理活性物質を生産する方法に関する
    [0004] 本発明の TCF- I [ 、 肝細胞増殖因子、 腫瘍細胞障害活性因 子等と して医薬あるいは生化学的も し く は薬理作用の試薬等 の分野で有用である。
    [0005] 背 景 技 術
    [0006] ヒ ト由来の線維芽細胞が産生する生理活性物質、 例えば腫 瘍細胞障害因子と しては iS—ィ ンタ ーフ ュ ロ ンが代表的な物 質である。 これは線維芽細胞を培養後、 細胞をハーべス ト し ついでボリ I —ボリ Cやセ ンダイ ウ ィ ルスで剌激する と細胞 外に分泌される糖蛋白質であり、 抗ウ ィ ルス 、 抗腫瘍効果の 他に、 種々の生理活性を示すこ とが明らかになつている。 特 開昭 58- 146293 号公報には、 CBF と呼ばれる線維芽細胞由来 の腫瘍細胞障害性糖蛋白質が開示されている。 特開昭 6 】 - 33120 号公報には ヒ ト組織由来の線維芽細胞培養液よ り抽出 される分子量 35,000〜45,000の腫瘍増殖阻害因子 ΠΝΓ' が開 示されている。 又、 特開昭 61-561,3]号公報には線雄芽細胞よ り抽出される腫瘍壊死因子様物質か、 特開昭 61-187 号公報 は、 線維芽細胞由来壌死因子 FNF 、 特開昭 62-103021 号 公報には、 動物線維芽細胞から産生される分子量 40,000〜 60,000、 等電点 5. 0 ± 0. 5の細胞障害作用を有する生理活性 物質がそれぞれ開示されている。 さ らに、 特開昭 64-10998号 公報には、 ヒ ト由来の線維芽細胞の培養上清から得られる分 子量 36,000 ±1,000 , 等電点 10.5以上の腫瘍細胞障害因子の 全ァ ミノ酸配列およびこれをコ一ドする cDM配列が開示され ている。
    [0007] 発 明 の 開 示
    [0008] 本発明者らは、 ヒ ト由来の線維芽細胞の培養上清に舍まれ る生理活性物質について検索を進めた結果、 従来報告されて いる物質とは分子量、 等電点等において異なる種々の生理活 性を有する糖蛋白質を見出して特許出願した（PCT/JP 90/003 14) (国際公開番号 W0 90/10651 国際公開日 1990 年 9月 2 0 H ) 。
    [0009] このヒ ト線維芽細胞由来の新規な糖蛋白質 （TCF- Π ) は下 記に示す物理化学的特性により特定される糖蛋白質である。 a.分子量 ； SDS 電気泳動法による分子量測定で、 非還元では 78,000± 2,000 又は 74,000 ± 2,000 の分子量であり、 還元 した場合、 52,000 ±2，000 の共通バン ド Aと、 30,000 ± 2, 000 のバン ド B及び 26, 000 ± 2,000 のバン ド Cの 2本の バン ドを示す。
    [0010] 等電点 ； 7.4〜 8. 6
    [0011] c.熱安定性 ； 6 0 t , 1 0分間の加熱によつても安定 d. pH安定性'； pH 6〜 9 の範囲で安定
    [0012] e.糖鎖 ； コ ンカナバリ ン A (ConA)セ フ ァ ロースに吸着性を示 f.生理活性 ； KB細胞、 HeLa細胞、 L 一 929 細胞の増殖を抑制 し、 IMft-90細胞の増殖を抑制しない。
    [0013] g.抗体との反応性 ； 抗 TN'F 抗体、 抗リ ンホ トキ シ ン抗体、 抗 ィ ンターフ ュ ロ ン /3抗体によって障害活性が中和され い, さ らに、 本発明の TCF- Π は、 下記の N末端ァ ミ ノ酸配列 及びア ミ ノ酸組成を有するものが好ま しい。
    [0014] h. N末端ァ ミ ノ酸配列 ； 上記 B及び Cがバン ド Aのサブチヱ — ンとなっており、 又バ ン ド Aは N末端ア ノ酸がブ口 .,' ク されている。 サブチヱー ン B及び Cは共に以下の N末端 ァ ミ ノ酸配列をもつ ；
    [0015] Val-Val-Asn-Gly- Ile-Pro-Thr- またに
    [0016] Val-Val-Asn-Gly-I le-Pro-Thr-X-Thr-Asn - He
    [0017] - Gly-X-Met-Va卜 Ser- Leu
    [0018] ただし Xは未同定を意味する。
    [0019] i.ア ミ ノ酸組成 ； 塩酸で加水分解する と次のア ミ ノ酸組成を 示す。
    [0020] A. A nmo 1 mol %
    [0021] Asp 10.375 12.97
    [0022] Glu 7.750 9.69
    [0023] Ser 5.000 6.25
    [0024] Gl 7.250 9.06
    [0025] H i s 3.000 3.75
    [0026] Arg 5.37 6,72 Thr 5.125 6.41
    [0027] Ala 2.625 3.28
    [0028] Pro 5.625 7.03
    [0029] Tyr 3.875 4.84
    [0030] Val 4.125 5.16
    [0031] Met 1.875 2.34
    [0032] Cys ND
    [0033] He 5.000 6.25
    [0034] Leu 4.875 6.09
    [0035] Phe 2.250 2.81
    [0036] Trp ND
    [0037] し ys 5.875 7.34
    [0038] 合計 80.000 100 (99.99)
    [0039] さらに、 本発明者らは TCF- IIのア ミノ酸配列をコー ドする 塩基配列を決定し、 上記特許出願明細書中に記載した。 すな わち、 本発明者らは、 下記に示す手順に従って、 ヒ ト胎児肺 由来線維芽細胞（IMR-90)から、 TCF- Πをコー ドした mRNAを精 製した後、 その遺伝子をクローニ ングして塩基配列を決定し. その塩基配列からァ ミノ酸配列を推定した。
    [0040] (1) IMR-90細胞からのポリ （A)+ RNA の抽出
    [0041] 5 % ©New born calf serum (N'BCS)を添加したダルべッコ 改変ィーグル（DME)培地を用いて培養した IMR-90細胞 2 X 108 個から、 グァニジ ンチオ シァネー ト一塩化セ シウ ム法（B i 0 - chemistry 18 5294-5299 (1979) ) によ り ト ータル RNA を調 製した。 I MR- 90細胞に 6 Mグァニジ ンチオ シァネー ト、 5 m! ク ェ ン酸ナ ト リ ウ ム、 0.5 %ザルコ ： ール、 0.1 M -- メ ルカ ブ トエタノ ール溶液 2 8 ¾βを添加し、 ホモ ジ ィ ナイ ズした。
    [0042] 4 fflfiの 5. 7 Μ塩化セ シウ ム、 0. 1 M EDTA溶液をポ リ ア ロマ 一遠心管に入れ、 その上にホモ ジ ィ ナイ ズ溶液 7 をのせ、 ベ ッ ク マ ン超遠心機 4 0 Ti 口 一ターで 35, OOOrpm, 20。 (： 、 16時 間超遠心分離を行った。 遠心後、 沈鏺を 9 5 %エタ ノ ールで 2 回洗浄し、 2 0 0 1 の 10mM ト リ ス塩酸緩衝液 （PH 7. 5 ) , 1 m EDT 溶液て' 6 5 て、 δ分間加熱する こ とにより溶解し. 卜一タル RNA 溶液と した。 ト一タル から 、 オ リ ゴ （dT)セ ルロースカ ラ ム ク ロマ ト法によ り 、 ポ リ （A) ' RNA を精製し た。 ォ リ ゴ（dT)セルロースカ ラ ムを 1 0 ηιΜ ト リ ス塩酸緩衝液
    [0043] (pH7.4) , 1 mM EDTA, 0.5M 塩化ナ ト リ ウ ム 、 0.05%SDS で 平衡化し、 トータル RNA を通し、 吸着画分を 1 0 mM ト リ ス塩 酸緩衝液 （PH7.4) , 1 mM EDTA, 0.05 %SDS で溶出し、 ポリ
    [0044] (A) - RNA 溶液と した。
    [0045] (2) cDNA の合成
    [0046] (1)で得た po : (A) - RN を铸型と して、 cDNA合成キ ッ ト (フ ア ルマ シア社） によ りニ本鎮 cDN Aを作成し、 EcoRI ァダ プタ一を付加した。 作成方法は同社のプロ ト コ一ルに従つた が.、 一本鎖 cDNAの合成の際、 ト リ骨髄芽球症ウ ィ ルス由来の 逆転写酵素（AMV RTase) を添加する改良を加えた （ 4 0 unit s/反応系、 ラ イ フサ イ エ ンス社） 。
    [0047] (3) c NA ラ イ ブラ リ 一の作成
    [0048] (2)で得た - cDNA をフ ァ ージベク ター gtlOの EcoRI arm (プ π メ ガ社 > に組み込んだ。 3.3 μ g のポ リ （ A ) * RN A から Ά. 成した cDNA を 150/ 1 の 66mMト リ ス塩酸緩衝液 （pH7.6)、 I mMスペルミ ジン、 10mM塩化マグネシウム、 15mMジチオス レ ィ トール、 0.2 mgZ ゥ シ血清アルブミ ン溶液 （カ ラム緩衝 液） に溶解し、 このう ちの 5. 2 1 を の / I gtlO EcoRI armと混合後、 エタノ ールで沈澱させた。 この沈澱を 9 〃 1 のカ ラム緩衝液に再溶解し、 1 μ 1 の lOmMアデノ シン三リ ン 酸、 1 1 の T4 DNAリ ガーゼ（350 units/ 1 ) を加え、 16 •Cで一晩反応し、 ス gtlOと cDNAの組換えファージ DNA を作成 ί 一 c
    [0049] (4) cDNA ライ ブラ リーのスク リ ーニング
    [0050] ( i ) オ リ ゴヌク レオチ ド プローブの作成
    [0051] TCF- Π β鎮の Ν末端の 1 番目から 6番目のァ ミ ノ酸配列に 相当する 1 7 mer の相補鎖ォ リ ゴヌク レオチ ド混合物（384種 mix)を合成し、 T4ポリ ヌク レオチ ドキナーゼ （宝酒造社製） r -3Z P ) ATP (アマシ ャ ム社） を用いて 5' 未満を標識 してプローブとして用いた。 このプローブは下記で示される c プローブとして用いる相補鎖 （384 種 mix) :
    [0052] 3' -CACCACTTACCGTAGGG -5 '
    [0053] G G G C A A A A T T T T
    [0054] ( ii：) 組換えファージのスク リ ーニング
    [0055] (3)で作成した組換えファージ DNA 溶液を Gigapack Gold (ス ト ラタ ジーン社） を用いて in vi troで packaging し、 大腸菌 C600hflに感染させ、 約 50万個のファージのプラークを得た。 プラ一クを Hy bond- フ ィ ルター（アマシャム社）に吸着させ 後-、 フ ィ ルターをアルカ リ変性、 中和後、 80て 2時間 baking した e ハイ ブリ ダィ ゼーシ ョ ン'は . Bell ら (Nature 310 77 -777 (1984) の方法に従い.、 ( i ) で作成したプローブで一 次スク リ ーニ ングした。 一次ス ク リ 一ニ ンダで陽性てあった プラークのなかに TCF- Π cDNA 断片を舍むと思われるク ロー ン力く 1 つ得られた。
    [0056] (5)ア ミ ノ酸に翻訳される全領域を含む TCF- Π cDNA のク ロー 二 ング
    [0057] TCF- Π の /9鎖 N末端ア ミ ノ酸配列および 鎮および β の リ シルェ ン ドぺプチダーゼ処理によ り得られたそれぞれ一き ί; 内部ァ ミ ノ酸配列 （ ατ ) ( 1 文字表示） NYMGNLSQTRSGL およ び （/5 ) TSXSVYGWGYTGLIKYDGLL (X は未同定を示す） 力く、 ヒ ト肝細胞増殖因子（hHGF)のァ ミ ノ酸配列とよ く 一致している ため、 TCF- Π は hHGFの遺伝子ファ ミ リ 一の一種と考えられた c hHGF こつ ヽて Iま、 宮沢ら（Biochemical and Biophysical Research Communication 163 967-973 (1989) ) , 中村（Nature 342 440-443 (1989) )によ ってその cDNAの塩基配列が報告さ れている 、 両者でァ ミ ノ酸配列が 1 4箇所異なり、 hHGF遣 伝子フ ァ ミ リ ーの存在が示唆されていた。 そ こで両者で一致 している、 ポリ ヌ ク レオチ ド鎖コー ド領域周辺の 5 ' —およ び 3 ' —非翻訳領域の DNA の塩基配列を基にプライ マーとな るオ リ ゴヌク レオチ ドを合成し、 Polymerase Chain Reaction (PC ) 法による TCF- Π cDNA の検索を行った。 まず.、 DNA 台 成機 （アプライ ド社） により制限酵素 Sai lの認識配列を有す る Sa卜 77プラ イ マーと、 制限酵素 Sphlの認識配列を有する Sph2203 プライ マーを合成した。 これらプラ ィ マ一を下記に 示す。
    [0058] Sal-77プラ イ マー ：
    [0059] 5 ' -GGTCGACTAGGCACTGACTCCGAACAGGATTC -3'
    [0060] Sal 1
    [0061] Sph2203 プラ イ マー ：
    [0062] 5 ' -GGCATGCACAGTTGTATTGGTGGGTGCTTCAG-3 '
    [0063] SPh I
    [0064] PC 法によるク ロ一ニングは以下の手順で行つた。
    [0065] ( i ) PC
    [0066] (2)で合成した cDNA(150 μ I のカ ラム
    [0067] 緩衝液に溶解） 1 1
    [0068] 2 0 M Sal-77 ブラ イ マー 2. 5 1
    [0069] 2 0 M Sph2203フ'ラ イ マー 2. 5 1
    [0070] 1 0 xPCR反応液（500mM塩化力 リ ウム、 lOOmM ト リ ス塩酸緩衝 液 （pH8.3)、 1 5 mM塩化マグネシウム、
    [0071] 0. 1 % (w/v) ゼラチ ン） 1 0 μ
    [0072] 1.25mM dGTP, dATP, dTTP, dCTP混合液 1 6 1
    [0073] Ampli Taq ( δ units/ μ 1 宝酒造） 0. 5 〃 】 蒸留水 6 7. 5 / 1
    [0074] 上記の溶液を 0. 5 用の微量遠心チューブ中で混合後、 ミ ネラルオイ ル （シグマ社） 約 100 μ 1 で液面をおおった後、 Quick Thermo System (日本ジエネテイ クス社） により PCR を行った。 反応条件は次に示した。 9 4 てで 7分前処理後、 5 5 て 3分 （アニーリ ング反応） 、 7 2 て 4分 （ポリ メ ラーゼ反応'） 、 9 4 X 2分 （変性） の三段階の反応を 3 5 画繰り返した後、 後処理と して 5 5 て 3分、 7 2 て 1 1 分処理し、 室温に戻した （ （注） それぞれの時間は温度が変 化する時間も舍む。 ） 。 反応液のう ちの一部をァガロースゲ ル電気泳動にかけたとこ ろ約 2. 3 キロベース （Kb') の DNA 断 片が得られ、 これが目的の TCF- Π cDNA と考え られた。 そこ で反応液 4本分から得た DNA をエタ ノ ールて'沈殺させた後、 制限酵素 Sailと Sphlで消化し、 ァガロースゲル電気泳動にか け、 DE81ペーパー （ヮ ッ トマン社製） で約 2.3Kb の DNA 断片 を回収した。
    [0075] ( ϋ ) サブク α—ユング
    [0076] ( i ) で得られた制限酵素 Sailと Sphlで消化された約 2. 3 Kbの cDNA断片を、 プラス ミ ドべク ター pUC18(日本ジーン社製） を制限酵素 Sailと Sphlで消化したべク ター断片にラ イ ゲーシ ヨ ンキ ッ ト （宝酒造社製）を用いて挿入し、 大腸菌 DH5 a (BRL社 製）の形質転換を行った（BRL社添付のプロ トコールに従った）。 結果と して、 20偭以上のサブク ローンを得る こ とが出来た。
    [0077] ( iii ) 塩基配列决定
    [0078] 得られたサブク ロー ンについてダイ デォキシ法 （ Sequenase Ver.2.0 東洋紡製）により塩基配列を決定した。 Ampi Taq (宝 酒造社製） のヌク レオチ ド取り込みの ミ スを複数個のサブク ロー ンの塩基配列を解析する こ とにより補正した。 上述のよ う に して得られた TCF- D cDNAの塩基配列と、 その配列から 予想されるァ ミ ノ酸配列を第 1図に示した。 翻訳開始信号 ATG から停止信号 TAG まで 2Π2塩基対（bp)であり 、 マ ； ノ 酸に ϋ 訳する と 723 個のア ミ ノ酸配列からなり 、 1 番目のメ チォ二 ン残基から 29番目のァ 二 ン残基までがシグナル配列と予想 された。 TCF- J は .、 鎖、 β鎖の二本のポリ ぺプチ ド鎮がジ' スルフ ィ ド結合している力；、 第 1 図に示すように最初は 1 本 のポリ ぺプチ ド鎖として合成される こ とがわかった。 TCF - Ε の or鎖の Ν未端はブロ ッ ク されているために不明である力 β鎖の Ν末端および or鎖， β鎖の一部内部ァ ミ ノ酸配列が前 述のごと ぐ決定しており、 第 1 図中に示した。 得られた TCF - H cDNA の塩基配歹 IIは宫沢ら（Biochemical and Biophysical
    [0079] Research Communication 163 967-973 (1989) ) の発見し た hHGFと極めてよ く 一致するが宫沢らの hHGFのァ ミ ノ酸配列 でいう と、 162 番目のフエ二ルァラニンから 166 番目のセ リ ンまでの 5残基（F-L- P- S-S) が、 今回の TCF- H cDNA でば欠 失している点が異なり、 TCF- II cDNA は新しい HGF 遺伝子フ ァ ミ リ ーの遣伝子の 1 つである ことがわかった。
    [0080] 本発明は、 このよう にして得られた TCF- Π の cDNAに関する 知見を基に、 この cDNAを発現ベクター中に組み込み、 TCF- H を遺伝子工学的手法によつて製造しょう とするものである
    [0081] (以下、 遺伝子工学的手法によつて得られた TCF- Πを rTCF- D という） 。
    [0082] 従って、 本発明の課題は、 TCF- D のア ミ ノ酸配列をコー ド する DNA を舍む発現ベク ターの構築とこの TCF- II発現べク タ 一で形質転換された形質転換細胞及びこれを用いて rTCF- Π あるいは肝細胞増殖因子を製造する方法を提供する こ とにあ る c
    [0083] 本発明は'、 このような課題を解決するためになされた σ であって、 まず、 TCF- Π のマ ミ ノ酸配列をコ一 ドした D を i I 舍む発現プラ ス ミ ドに閔する。
    [0084] 発現ベク ターと しては pc DNA I (イ ンビ ト 一ジェ ン社） pMNSMUsuchiya他- Biochemical and Bioph sical Research Communication 158 576-583 (1989)) などがあげられる。
    [0085] 本発明のプラス ミ ドは、 一般に次の方法で作製される。 す なわち、 まず前記したよう に PUC18 ブラス ミ ドベクター （日 本ジーン社製） にサブク ローニングされている TCF- D cDNA を制限酵素を用いて切り出し、 一方例えば発現ベク ター PC DNA I (イ ンビ ト ロージヱ ン社製） から制限酵素を用いてプ ラ ス ミ ド断片を切り出す。 そ して両断片をリガーゼを用いてラ ィ ゲーショ ンし、 TCF- Π cDNA 断片を pcDNAI断片中に挿入し て TCF- Π発現プラス ミ ドを構築する。
    [0086] TCF- Π cDNA 、 ブラス ミ ド断片等の切出しは従来知られて いる種々の制限酵素が用いられる力く、 特に BamHI 、 Sphl等を 用いる ことが好ま し く 、 また リ ガ一ゼと しては T4リ ガーゼを 用いる こ とが好ま しい。 プラス ミ ド断片の切り出し、 あるい はライ ゲ一ショ ンの方法は従来知られている通常の手段によ つて行う こ とができる。
    [0087] また、 本発明では、 次の第 4図に示す方法によって rTCF- Π を大量に発現させる こ とのできる TCF- Π大量発現プラス ミ ド pCDTCFdhを構築する こ とができ る。
    [0088] マ ウ ス DHFR遺伝子発現プラ ス ミ ド PAdD26SVpA(3)(Proc. Natl Acad. Sci . USA, 82, 689- 693 (1985) )を EcoR i と Banil , ¾ よひ BamH I と Ps 11とでそ ぞれ別に消化し、 i % MEァ力 π一 スゲル（宝酒造社製）電気泳動により、 それぞれ 1.8Kb 、 0.5 Kbの DNA 断片をあらかじめ EcoRI 、 Ps 11で消化したブルース ク リ プ ト SK （ス ト ラタ ジーン製） と混合し、 T4 DNAリ 力一 ゼでラ イ ゲーシ ヨ ンを行い、 マウ ス DHFR遺伝子発現プラ ス ミ ド pBAdDSV を得た。
    [0089] プラス ミ ド pBAdDSV を EcoRI と Spelで消化した後、 ク レノ ゥフ ラ グメ ン トで平滑末端と した後、 1 %MEァガロース電気 泳動により、 2.4Kb の DNA 断片をあらかじめ Nae]で消化した TCF- Π発現プラ ス ミ ド （第 2図 6.3Kb)に T4 DNAリ ガーゼに より挿入し、 TCF- Π大量発現ブラ ミ ド pCDTCFdhを得た。 この よう にして得られたプラス ミ ド pCDTCFdhは、 サイ トメ ガロウ ィ ルスプロモーターと SV40初期遺伝子関連のスプライ スシグ ナルおよびポリ （A) 付加シグナルの間に TCF- Π遺伝子を有す る TCF- Π発現単位と、 アデノ ウイルス主要後期プロモータと SV40初期遺伝子関連のポリ （A) 付加シグナルの間にマウス DH FR遺伝子を有するマウス DHFR発現単位の双方を舍むブラス ミ ドである。
    [0090] こ のよ う にして得られた TCF- D発現ブラス ミ ドを大腸菌を 用いて増幅し精製を行う。 大腸菌としては、 市販されている MC1061/P3 等種々のものが用いられる。 プラス ミ ドを組み込 んだ大腸菌を、 ァ ンピシ リ ン等を舍む培地中で培養して増幅 するとともに選択を行い、 さ らにプラス ミ ドを取り出して精 製する。 本発明の発現ブラス ミ ド第 2図を大腸菌 MC1061/P3 に組み込んだ形質転換体は微ェ研に寄託している ί受託番号 ¾ェ研条寄—第 3479号（FERM BP- 3479)〕 。 O
    [0091] 本発明は、 また、 このよう にして得られた TCF- U 発現 ラ ス ミ ドを細胞中に組み込み、 得られる形質転換された細胞に 関する。 細胞と しては C0S-1 細胞、 CH0 細胞、 Namalwa 細胞 Φ 2 細胞、 ΠΗ3Τ3細胞、 BM 細胞等の動物細胞を用いる こ と が望ま し く 、 その形質転換法は、 従来用いられている リ ン酸 カルシウ ム法、 DEAE - デキス ト ラ ン法、 リ ボフヱク チ ン法、 エ レク ト ロポ レーショ ン法等の通常の方法が用いられる。
    [0092] さ らに、 本発明は、 このよう にして得られた形質転換体を 培養し、 その培養液から rTCF- Π を採取する方法に閬する。 培養に当っては、 W090/10651に記載される方法で培養すると よい。 すなわち、 動物細胞を血清培地も し く は無血清培地中 で増殖させる。 代表的な培地の例と してはダルベッ コ一モデ フア イ ドィ ーグル培地（DMEM)に子牛血清を 5 %添加した培地 が挙げられる。 この他に必要に応じ、 ア ミ ノ酸、 ト ラ ンスフ エ リ ン、 脂肪酸、 ィ ン シユ リ ンなどのホルモ ンを添加しても よい。
    [0093] こ の培地中で細胞を培養する力 培養に当っては、 Tフ ラ スコ等を使用した静置培養、 マイ ク ロキャ リ ア一を使用した 浮遊培養、 ホ ロ一フ ァ イ バ一やセ ラ ミ ッ ク担体を使用した連 続培養の方法が採用し得る。 培養条件は、 5 %C02 、 95%空 気雰囲気下で、 20〜37ての温度、 培地は 2 〜 3 日ごとに交換 する こ とが好ま しい。 このよう にして所望の細胞密度に到達 した後は、 7 〜10日ごとに培地を交換し、 培養液を回収する : 回収した培養液より 目的物質である糖蛋白質を抽出精製する t 回収した培養液は分子量 6, 000 以下をカ ツ トする UF膜処理 により約 10倍に濃縮し、 その後、 陽イ オ ン交換体に吸着させ た後、 NaCl濃度 0. 3 M 〜 0. 6 M の緩衝液で溶出する。 イ オ ン 交換体としては CMセ フア デッ ク ス （ フ アルマシア社製） 等力く 例示できる。 このよう にして溶出される活性画分のう ちでラ ト肝実質細胞の増殖活性、 も し く はマウ ス L929細胞に対す る細胞障害活性を指標と して最も強い活性を示す画分を集め、 さ らに糖ァフ ィ 二ティ一ク ロマ トグラフ ィ 一を行う。 糖ァフ ィ ニテ ィ 一ク ロマ ト グラ フ ィ 一と しては ConA—セフ ァ ロース が適している。 糖ァフ ィ 二ティ ーク 口マ トカ ラムは 0.5M NaCl を舍む PH7.0 の 0.05M ト リ ス塩酸緩衝液で平衡化した後、 上 記回収画分を負荷し、 さ らにカ ラムを洗浄する。 その後糖ァ フ ィ ニティ 一の結合糖鎖に応じた溶出液で溶出する。 上述し た Con Aセファ ロ一スを使用した場合は、 一メ チル— D —マ ンノ ピラノ サイ ドを舍む緩衝液で溶出される。 溶出された活 性画分は、 水に対して透折を行い、 凍結乾燥する。 その後 P!i 6.0 〜7.0 の 0.05M ト リ ス塩酸緩衝液に溶解し、 強陽イ オ ン 交換樹脂を充瑱剤と した HPLCにより さ らに分離精製を行う。 強陽ィ ォ ン交換樹脂充塡カラム と しては MonoS (フ ア ルマ シア 社製） が特に適する。 MonoS カ ラムからの溶出は、 0M— 1.0M の NaClのグラジェン ト溶出を行い。 活性画分を集める c
    [0094] rTCF- D は、 0.6M〜0.9Mの塩強度部分に溶出される こ の よう に して得られた活性画分をさ らにへパリ ンーセ フ ァ ロー ス （. フ ア ルマ シア社製） を使用したァ フ ィ 二テ ィ ーク 口 マ ト グ ラ フ ィ一'によ り精製する。 へパ リ ン一 セフ ァ ロースカ ラム からの溶出は 0.3M→2.0Mの NaClグラ ジェ ン トで行い、 目的物 質':'よ 1,0 〜1.5Mの塩強度部分に溶出される。 次に、 rTCF- II の肝細胞増殖活性の測定について記述する。
    [0095] セ ク レ ンの方法（ ethod i n eel！ b i o i o g . v o 1 13. p29. Academic Press. New Y'or k . ( 1976 ) ) こ従 tヽ、 ゥ ィ ス 々一系雄 ラ ッ トより肝実質細胞を単離した。 この肝実質細胞を 8. > - 1 0 4 個 /0 , 5 ra£ /ゥ エ ルの濃度で 2 4 ゥ エルのプ スチ ·' ク プレー ト （ フ ァ ルコ ン社製） に插き .、 5 %の CO 2 存在下 3 7 てで培養した。 培地は . 1 0 %牛新生児血清 (ハイ ク 口
    [0096] r
    [0097] ン） 、 10 デキサメ タ ' / ン 、 100L ぺ二 ；: ：！ ： . lOOug i ス ト レプ トマイ シ ンを舍むウ イ リ ア ズ E培地 （ フ ローラ ボラ ト リ ーズ社製） を使用した （以下、 基礎培地という ） 。 24時間培養後、 被験試料を含む基礎培地に交換し更に 2 4 時 間培養の後、 3H—チ ミ ジ ン （アマシャム社製） を 4 Ci/ (86Ci/mm0 )を舍む基礎培地に交換し 2時間培養した後、 DNA 合成を測定した。 上記培養によるラベル後、 細胞を冷 PBS、 10%過塩素酸及び 95%ェタノ ールて、 それぞれ 2 回洗浄した のち風乾し、 10mM 塩化マグネ シウ ムを舍む、 10%SDS の 0.8m) で可溶化し、 液体シ ンチ レ一 シ ョ ンカ ウ ンタ一にて測定した < 純化した rTCF- Π に対する肝細胞増殖活性の例を第 1 表 示す。
    [0098] 弟 1 表
    [0099] 被 度 BT- m B¾I +tt Kft Ά if ΒΛ ¾¾料 濃
    [0100] (ng /mi ) ( dpm/wel 1 , xlO3) 無添加 2 L 7 ± 9. 2
    [0101]
    [0102] 薬） を用いた。 表より rTCF- D の肝細胞増殖活性は、 hEGF© それより強いことが判る。
    [0103] 本発明の rTCF- Πは、 肝実質細胞の増殖因子となるほか、 腫瘍細胞障 因子、 白血病株分化誘導因子、 細胞免疫活性因 子、 血管内皮細胞増殖因子となる。
    [0104] 図面の簡単な説明
    [0105] 第 1図 a及び第 1図 b は、 TCF- Πのァ ミノ酸配列及びそれ をコー ドする塩基配列を示す。
    [0106] 第 2図は、 本発明の TCF- Π発現プラスミ ドの作製方法の概 略図を示す。
    [0107] 第 3図は、 TCF- Πの発現の状況を示す。
    [0108] 図中、 一一〇一一 は TCF- Π遺伝子を保有しない細胞の HGF 活性 TP:し は TCF- II遺伝子を保有する細胞の
    [0109] HGF 活性を示す。
    [0110] 第 4図は、 本発明の TCF- Π大量発現ブラス -Η ドの作製方法 Ο概 ¾図を示す。
    [0111] 第 5図は、 形質転換ナマルヮ （Namait a)細胞培養液 （ 5 % CS舍有.） の CMセ フ " テ "； ク ス Γ-50力 ム ク 匚 'マ ト ' - つ 一 を示す。
    [0112] 図中'、 （1)は 0.3 1 NaC】 および 0.01%ツイ ー ン 2 0 を舍む
    [0113] 0.05. ト リ ス —塩酸緩衝液 （PH6.8 〜7.0)、 （2)は NaCl および 0.01%ッィ ー ン 2 0 を舍む G.05. ト リ ス 一塩酸緩衝液 (PH7.0) によ る カ ラム ク ロマ ト グラ フ ィ ーを示す。 —— O— は吸光度（OD.280nm)、 一一 ·—— は L929- C18株に対する細胞 障害活性を示す。
    [0114] 第 6図は、 CMセ フ ァ テ ッ ク ス C 50ク ロマ 卜グラ フ ィ ーから の rTCF- Π溶出液（0.6M NaCl溶出画分） の Con A セ フ ア コ一 ス Cい 6B ァ フ ィ 二テ ィ ク ロマ ト グラ フ ィ ーを示す。
    [0115] 図中（1)は 0.5M NaCl 含有 0.05M ト リ ス —塩酸緩衝液 （PH7.0)、 (2)は 0.5M NaCl 、 0.01%ツイ ーン 2 0 および 0.3M α—メ チ ルー D—マ ンノ ビラ ノ サイ ド舍有 0.05Μ ト リ ス—塩酸緩衝液 (ΡΗ7.0)による カ ラム ク ロマ ト グラ フ ィ ーを示す。 ——〇—— は吸光度（OD.280nm) , 秦 は L929- C18株に対する細胞 障害活性を示す。
    [0116] 第 7図は、 Con A セ フ ァ ロース -6Β ァ フ ィ 二テ イ ク ロマ ト グラフ ィ一からの rTCF- H溶出画分の Mono S-HPLC を示す。 図中、 は吸光度（0D.280nm)、 —一 #—— は L929-C1S 株に対する細胞障害性、 --……は C1濃度勾配をそれぞれ示す
    [0117] 第 8図は、 Mono 5-HPLC からの rTCF Π溶出画分のへハ。 ' ン -HPLC を示す。
    [0118] 図中、 一"― は吸光度（0D.280nm. ——參—— し 92 1 対する細胞障害活性、 一… は aC 度勾配をそれぞれ示- 第 9図は、 rTCF- Π (非還元及び還元） の SDS 電気泳動を 示 3
    [0119] 第 1 0図は、 rTCF- Πの各種腫瘍細胞株に対する細胞障害 活性を示す。
    [0120] 図中、 ——▲—— は Sarcoma 180 、 ——秦—— は Meth A sarcoma 、 ——厶一一 は KB 、 ——〇—— は IMR-90 に対す る細胞障害活性をそれぞれ示す。
    [0121] 第 1 1図は rTCF- Π の肝細胞増殖活性を示す。
    [0122] 発明を実施するための最良の形態
    [0123] 以下に実施例を示し、 本発明をさ らに具体的に説明する。 実施例 1
    [0124] (DTCF- Π発現ブラスミ ドの構築
    [0125] 第 2図に示すように PUC18 プラス ミ ドベクター（ 日本ジー ン社） にサブクローユングされた TCF- Π cDNA (第 1図） およ び pcDNA I 発現べクター（ イ ンビ ト ロ一ジヱン社） を以下の 制限酵素処理により切り出しそれらの DNA 断片を得た。
    [0126] TCF- Π cDNA が挿入された pUC18 プラスミ ド 1 gおよび- pcD A I プラス ミ ド 1 〃 gをそれぞれ別々に 20mM Tris-HC £ ： PH8.5, 10mM MgC I 2 , 1 mM D i th i o thre i to】， lOOmM KC £ を舍むバッ ファー 1 0 / に溶解させ、 制限酵素 BamH I , Sph 1 それぞれ 1 ユニッ トずつを加え 3 7 てで 1 時間反応させた 後、 1 %MEァガロースゲル（宝酒造製）電気泳動にかけ、 DE81 ベーパー （ヮ ッ トマン社製） で約 2.3Kb の TCF- H cDNA 断片 および約 4. Kb の pcDN'A 1 断片を回収した。
    [0127] 次に TCF- Π cDN 断片を、 pcDNA I 断片に以下の反応によ り挿入した。
    [0128] TCF- D cDNA 断片 lOOng および pcDNA I 断片 5 O ngを 6 0 m.^ Tris-HC i , pH7.6, ImMATP, 1 milスペル'ミ ジ ン， 1 0 ηι .HgC ί t , 1 δ mM DTTを含むバ ッ フ ァ ー 1 0 1 に溶解させ-. 300 ュニ ッ 卜 の T4リ ガーゼを加え、 1 5 てで一晩ラ イ ゲ一シ ョ ンを行った。
    [0129] 次に、 上記反応液を用い常法に従い大腸菌 C1061/P3 の形 質転換を行い、 TCF- Π発現プラ ス ¾ ドを保有する形質転換菌 を得た
    [0130] こ の形質転換体は微ェ研に受託番号 微ェ研条寄第 3479号 (FER BP- 3479) と して寄託されている。 第 2図に、 構築した TCF- Π発現プラス ミ ドを示す。
    [0131] (2) TCF 発現ブラ ス ミ ドの調製と精製
    [0132] 上記の形質転換大腸菌を 2 5 μ g Z' のア ン ビシ リ ンを舍 む 1 £ の し培地で培養し、 0D600 が 0.8 を示した時点で、 終 濃度が 170 μ g Z idになるよう にク ロラムフエ二コールを加 え一晩培丧した Maniatis <ό (Molecular cloning 2nd edition) の方法に従いアル力 リ法およびポ リ エチ レ ングリ コ一 ル法で処理し、 塩化セ シウ ム密度勾配遠心法により、 TCF- B 発現プラス ミ ドを精製した。
    [0133] (3) TCF- D発現プラ ス ミ ドの勛物細胞への導入
    [0134] Parkerら（J. Virology 31 360-369. 1979) の方法に従い. Π ン酸カルシウム法によ り、 COS- I 細胞に TCF- Π発現プラ ミ ドを導入した。 ネガチ イ ヴコ ン ト 一ルと して pcD A I へ ク タ一のみを同様にして C0S-I ffl胞に導入した。 (4) rTCF- Π発現の確認
    [0135] プラス ミ ド:導入後、 7 2時間目の(：05-1 培養上清中におけ る、 rTCF- Π'の発現の有無を、 ラ ッ ト肝実質細胞の増殖活性 を指標と して検討した。 Gohda ら（J. Clin Invest. 81 414 -419, (1988))の方法に従い、 ラ ッ トの肝実質細胞の DNA 合成 能を3 Hサイ ミ ジンの取込み量で測定した。 その結果を第 3図 に示す。
    [0136] 第 3図に示されるよう に TCF- Π発現プラス ミ ドを導入して 72時間目の C0S-I 細胞上清中にラ ッ ト肝実質細胞増殖活性が 認められ、 rTCF- Πが発現しているこ とが確認された。 PCDNA I ベクターのみを導入した C0S-I 細胞中には、 増殖活性は認 められなかった。
    [0137] 実施例 2
    [0138] (DTCF- Π大量発現プラス ミ ドの構築
    [0139] 第 4図に示すよう に、 マウ ス DHFR遺伝子発現プラ ス ミ ド pAD 26SVPA(3) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 689-693, (1985)) を EcoRl と BamHI 、 および BaroHI と Ps 11とでそれぞれ別に消 化し、 1 %MEァガロースゲル （宝酒造社製） 電気泳動により、 それぞれ 1.8Kb、 0.5Kbの DNA 断片をあらかじめ EcoRI 、 Pstl で消化したブルースク リ プ ト SK十（ス ト ラタ ジー ン社製）と混 合し、 実施例 1 に示した方法に従い、 T4 DNAリ ガーゼでラ イ ゲーシ ヨ ンを行い、 マウ ス DHFR遺伝子発現プラ ス ミ ド pBAdDSV を得た。
    [0140] プラ ス ミ'ド pBAdDSV を EcoRI と Spelで消化した後、 ク レノ ゥ フ ラ グメ 卜で平滑末端と した後、 1 % MEァガロース電気 泳動により 、 2.4Kb の DM 断片をあらかじめ Naelで消化した TCF- Π発現プラ ス ミ ド （第 2図 6.3Kb)に T4 DMリ ガーゼによ り挿入し 、 TCF- Π大量発現プラ ミ ド pCDTCFdhを得た。 このよ う にして得られたプラス ミ ド pCDTCFdhは、 サイ トメ ガロウ イ ルスプロモーターと SV40初期遺伝子関連のスブラ イ ス シグナ ルおよびポリ （A) 付加シグナルの間に TCF - Π遺伝子を有する TCF- Π発現単位と、 アデノ ウ イ ルス主要後期つ'口モータ と 40初期遺伝子関連のポリ （A) 付加シグナルの間にマ ウ ス DHFR 遺伝子を有するマウ ス DHFR発現単位の双方を舍むプラス ミ ト- である。
    [0141] (2)TCF- Π大量発現ブラ ミ ドの ヒ トナマルヮ細胞への導入およ び TCF- Π遺伝子の発現
    [0142] TCF- Π大量発現プラ ス ミ ド pCDTCFdhを、 ヒ ト ナマルヮ細胞 ATCC CRL1432に下記に示すリ ポフエクチン法（Focus 11 (2), 37 (1989)) により導入した。
    [0143] pCDTCFdh プラ ス ミ ド 1 0 ^ g と pMC I neo プラ ス ミ ド 1 u も (フナコ シ社製）を 10 の TEバッ フ ァ一 （ 1 ϋ mfl Tris, 1 mM EDTA, pH7.5)に溶解し、 これに 1, 5 ¾6の OPT I - ME (ギブコ社 製） を加えた DNA 溶液を調製した。 リ ボフ ュ ク チ ン溶液は、 BRL のプロ ト コ ールに従い、 1.4 の 0PTI-MEMに 0.1 の リ ポフ ユ ク チ ン （ 1 g ノ m£ . BRいを加えたも 0を調製した c ナマルヮ細胞は、 1 X 1 0 7 eel Is を 0.3 m£ CD OPT I - M Mに懸 濁した 上記 溶液 1.5 iに 1.5 idの リ ポ一 ' ク チ ン 液、 0.3 ^のナマルヮ細胞懸濁液を加え、 軽く ピへ .:' テ ン グを して撹拌した後、 2 5 0«の丁フラ スコ （住友へ一ク ラ 9 0
    [0144] ト社製） に移し、 C0Z イ ンキュベータ一中で 4時間培養した 後、 7 ^の増殖培地 （ 1 0 %FCS を舍む RPMI- 1640 培地） を 加え、 一晩培養した。 その後増殖培地を交換して 3 日間培養 した後、 500 u g の濃度の G418 (シグマ社製） を舍む増 殖培地に交換してさ らに 2週間培養した。 得られた G418耐性 細胞を、 5 O nMメ ソ ト レキセー ト （MTX)、 1 0 %の透析1^5 を舍む or- MEM. (ギブコ社製）培地に懸濁し、 5000cel Is/well の濃度で 9 6 ゥヱルマイ ク ロプレー トにまき、 約 2週間培養 した。 得られた MTX 耐性細胞株から培養上清中の TCF- Π濃度 の高い細胞株を ELISA 法でスク リ ーニングした。 得られた TC F- Π高生産株を 1 0 %FCS 、 1 0 %ハイ プリ ドーマク ロー二 ングファ クター （オリ ジヱ ン社製） を含む RPMI-1640 培地で 限界希釈法により、 細胞のク ローユングを行ない、 得られた ク ロ一ンについて ELISA 法でスク リ ーニングし TCF- Π高生産 ク ローン G2H3C2を得た。 この細胞の培養上清中の TCF- II生産 能は約 1 m /£であつた。 この G2H3C2細胞は工業技術院微生 物工業研究所に受託番号 微ェ研条寄第 3480号（FERM BP- 3480: として寄託した。
    [0145] (3) rTCF- Π の精製
    [0146] 1)形質転換ナマルヮ（N'amalwa) 細胞（G 2H 3C 2)の培養
    [0147] RPMI 1640 に牛血清（CS)を 5 %添加した培地 2. 5 £に形質 転換ナマルヮ細胞を 4 X 1 05cells/fl iとなるように接種し-, 3 7 . 2 日間培養毎に同培地を 2. 5 £添加する流加培養法 により 2 0 £の培養液を採取した。
    [0148] 2 rTCF- Π の活性測定法 マゥス L929 (ATCC CCし 1)をサブク 口一二ングし TCF- Π に 最も感受性の高いサブク ロー ン L929- C18株を得た。 L929-C18 株を 1 0 %FCS を含むダルベ ッ コ改変イ ーグル培地（DMEM)で コ ンフルェ ン 卜になるまて'培養し、 その後 ト リ プシ ン処理に より細胞を剥離採取し、 1 0 % F S および 1 u g / のマク チノ マイ シ ン Dを舍む DMEMに 6 X 1 0 5 cel ls の細胞密 度になるよう に懸濁させる。 9 6穴マ イ ク ロ プレー ト ( フ ルコ ン社製、 3072) の各ゥエルに細胞懸濁液と同様に調製し た DMEMを 5 0 1 加え、 本発明 rTCF- Π を舍む、試料も同様 に調製した DMEMで溶解または希釈し、 希釈列の第 1 穴に 5 0 U 1 を添加し、 混合後、 その 5 0 1 を第 2穴に添加混合す る。 この操作を繰り返しながら希釈列を作成する。
    [0149] 試料の希釈列に各ゥエル当たり、 細胞懸濁液を 5 0 〗 づ つ添加し、 C02 イ ンキュベーター内で、 3 7 て、 2 日間培養 する。 培養後、 上清を静かに捨て、 生理食塩水で 2 回洗浄後、 各ゥエルに接着した生存細胞をメ タ ノ ール ： 水 = 1 : 4 の澄 合液に溶解した 0. 5 %ク リ スタルパィ ォ レ ッ ト溶液を 50 1 づっ添加し、 染色固定する。 蒸留水で各ゥエルを洗浄し、 染 色プレー トを風乾し、 色素をセ レ ンソ ン緩衝液 （ 6. 1 rn£、 0.1 M ク ェ ン酸ナ ト リ ウ ム 3. 9 、 0. I N塩酸、 1 0 ffl£エタ ノ ー ルを混合） で溶出し、 マイ ク ロタ イ ター分光光度計で 570 nm の吸光度を測定する。
    [0150] δ ϋ %の細胞死滅率を示 希釈率を TCF- Π の萆位数 ( u / mi ) と規定する。
    [0151] 3) rTCF- D の精製 1)で得た培養液 2 0 を HC1 で pH 6.2 〜7.0 に調整し、 こ れに予め PH7.0 の 0.05M ト リ ス塩酸緩衝液で平衡化した CMセ フアデッ ク ス C-50を湿重量として 1.5kg 加え、 PH 6.5 〜7.0 下でゆるやかに撹拌しながら 4 てで 2 4 時間吸着させた。 吸 着後、 樹脂をブッフナ一漏斗上、 ヮ ッ トマ ン No.2濾紙で濾過 し、 回収した樹脂は、 PH7.0 の 0.05M ト リ ス塩酸緩衝液で洗 浄した。 約 15Q0g の洗浄後の樹脂を径 7 cm X 4 0 cmのカ ラ ム に充塡し、 0.01%ッィ 一ン 2 0 および 0. 3 MNaCl舍有 0.05M ト リ ス塩酸緩衝液、 PH 7.0 で溶出した。 280nm の吸収をモニ ターし、 蛋白質がほぼ溶出し終えたところで更に塩濃度を 0. 6 Μ食塩に上げて溶出を行った。 各フラク ショ ンについて 細胞障害活性を測定した。 このよう にして得た溶出パターン を第 5図に示した。 0. 6 Μの NaCl濃度で溶出される画分に強 い細胞障害活性が認められた。 こ の画分を集めて rTCF- Π画 分と した。 次いで、 Con A セフ ァ ロース Cい 6B (フ ア ルマ シア 社製） を 0.5 MNaCK 1 mM CaCl2、 1 mM MgCl2 含有の pH 7.0 、 0.05M ト リ ス塩酸緩衝液で平衡化し、 径 2. 5 cm X 8 cm のカ ラ ムに充鎮した。 このカ ラムを同じ緩衝液でよ く洗浄し, CMセフ ア デ ッ ク ス C- 50カ ラ ムク ロマ ト グラ フ ィ ーで溶出され た rTCF- II画分（pH7.0) を負荷した。 その後再度カ ラ ム容量 の 1 0倍量の 0.5 Mの NaCl舍有 p .O 、 0.05M ト リ ス塩酸緩 衝液でカ ラ ムを洗浄した後、 0. 5 MNaCl、 0,01%ツィ ーツ 20 および 0. 3 M a—メ チル一 D マ ンノ ビラノ サィ ド含有 PH 7.0 、 0.05M ト リ ス塩酸緩衝液で 1 時間当たり 7 0 の流速 で溶出した。 各溶出画分は細胞障害活性を測定すると共に 280nit) の蛋白吸収をモ ニター 第 6図に溶出パター ンを 不
    [0152] 最初に溶出される画分を回収し、 NaCl濃度が 0. 3 M以下と なるよう に、 0.01 Mリ ン酸緩衝液、 PH 7. 0 で希釈した。 希釈 液の PHを再度 G.5 〜7.0 となるよう に調整した後、 0.01 %ッ ィ ー ン 20舍有 PH7.0 の リ ン酸緩衝液で平衡化した HPLC用 Mono S カ ラ 丄 （フ ア ルマ シア社製） に負荷した。 負荷後、 0.01% ツイ ーン 2 0舍有 PH 7.0 の 0.01 M リ ン酸緩衝液で 2 0分間、 0. 5 ιύ /分の流速で洗浄した後、 0. 5 mi /分の流速で 6 0 '分 間で最終塩濃度が 1 MNaClとなるような濃度勾配で溶出を行 つた。 溶出パターンは第 7図に示した。 活性画分は 0.76M C1を頂点と して溶出された。 精製度を上げるため活性画分を 回収し、 再度 Mono Sカ ラ ムに負荷し、 同じ緩衝液で、 NaCl濃 度 1 Mまでの濃度勾配で再度溶出した。
    [0153] 活性画分を回収し、 NaCl濃度が 0. 3 Mとなるよう に 0.01% ツイ 一 ン 2 0舍有 PH7.5 、 1 0 mil ト リ ス塩酸緩衝液で希釈後、 0.3MNaClおよび 0.01%ツイ 一ン 20舍有 pH7.5 、 1 0 mM ト リ ス 塩酸緩衝液で平衡化した HPLC用へパリ ンカ ラム （東ソ一社製） に負荷した。 負荷後、 0.3 MNaCl 0.01%ツ イ 一 ン 2 0舍有 PH7.5 、 1 O iriM ト リ ス塩酸緩衝液で、 流速 0. δ id /分で 2 0 分間洗浄した。 更に同じ PHの緩衝液を用い.、 流速 0.5 分 て' 6 0分間で NaC 1濃度が 0. 3 から 2. 0 Mになるよう な塩濃 度勾配で溶出した ί'き出パター ンを第 8図に示し 。 ：：のよ う に して rTCF- Π の精製標品を得た。 20 £ の培養液から 1] .G の活性な蛋白質を得る こ とが出来た： 細胞障害活性で測定 したこの精製蛋白質の比活性は約 530 万単位であった。
    [0154] (4) rTCF- Πの物理化学的諸性質
    [0155] 上記のようにして得られた rTCF- Πの物理化学的性質を測 定した結果を以下に示す。
    [0156] ① SDS 電気泳動法による分子量測定
    [0157] 0.1 % SDS を舍むポリ ァク リ ルァ ミ ドゲルを用いて電気泳 動による分子量測定を行った。 SDS 電気泳動パター ンを図 9 に示した。 rTCF- Π は非還元状態で 78, 000土 2, 000 及び 74,000 ± 2,000 の近接したバン ドを示した。 また 2 — メ ル力 ブ トエタノールによる還元処理した電気泳動では、 分子量 52, 000 ± 2, 000 の共通バン ド Aと 30,000 ± 2,000 のバン K B および 26, 000 ±2, 000 のバン ド Cからなる 3つのポリぺプチ ド鎖に分かれる。
    [0158] ② 等電点
    [0159] LKB 社製等電点電気泳動装置を用い Phast Gel IEF3- 9によ る等電点を測定したところ、 7.4 〜 8.6 の等電点を示した。
    [0160] ③熱安定性
    [0161] PH7.5 に調整した 0.01 %ツイ 一ン 2 0を舍む 0.1 M ト リ ス 塩酸緩衝液に 600u/ となるように rTCF- Πを溶解し、 この 活性を有する液を 2 5、 3 5、 5 0、 6 0、 7 0、 8 0、 90、 9 5 °Cの各温度で 1 0分間処理し、 2 5 T.の活性に対する相 対活性を求めた。 6 0 てまでは安定であった。
    [0162] ④ PH安定性
    [0163] 第 2表に示す組成の各緩衝液 （いずれも 0.01%ッィ 一ン 20 を含有） を調製し、 各 PHの緩衝液に 600u/ となる よ う に rTCF- Π を溶解し、 3 7 ΐて、 i 時間放置後の活性を測定し
    [0164] ΡΗ 8 、 室温で 1 時間放置した場合の活性を 100 %と し、 そ ぞれの ρΗでの活性を相対活性で求めた。 その結果、 ρΗ 6〜 9 の範囲で安定であつた。
    [0165] 第 2表 緩衝液
    [0166] 3 1/10 M グリ シン—塩酸
    [0167] 6 1/10 M 酢酸緩衝液
    [0168] 8 1/10 M ト リ フ 一塩酸
    [0169] 12 1/10 グリ ン'ン一水酸化ナ ト リ ウ
    [0170] ⑤ N末ァ ミ ノ酸配列
    [0171] 100 u g の rTCF- Πを還元し、 エ レク ト ロブロ ッ ト法によ り 、 分子量 52, 000の A、 32, 000の B、 26, 000の Cの 3つのポ リ ぺプチ ドに分離し、 各ボリ ぺプチ ド鎖についてアブラ イ ド 社製 477 A型プロティ ン シーク ェ ンサによ り N末ァ ミ ノ酸配 列を分折した。 Aは N末がプロ ッ ク されているためか分析で きなかったが、 B、 Cは共に下記に示す共通の N末ア ミ ノ 酸 配列を示した。
    [0172] Va Vaト Asn - G 1 y- I le-Pro- Thr- Arg - Thr - Asn - I le - Gly-Trp-
    [0173] 1 5 10
    [0174] Met - Val- Ser -し eu- Arg-Tyr- Arg- Asn
    [0175] 15 20
    [0176] Bおよび Cの N末ァ ミ ノ酸配列が全 く 同一である こ とから rTCF- Π は分子量 52, 000の A鎖と分子量 32, 000の B鎖あるい は分子量 26, 000の C鎖が S — S結合したへテロダィ' マー構造 を有している こ とが認められた c (5) rTCF- Πの生物活性
    [0177] 1)腫瘍細胞障害活性
    [0178] 供試腫瘍株としてヒ ト腫瘍細胞株、 KB及びマウス腫瘍細胞 株、 Sarcoma2- 180 および Meth A sarcomaを用いた。 また、 正 常細胞としてヒ ト胎児肺由来正常 2倍体線維芽細胞、 IMR- 90 を用いた。
    [0179] 腫瘍細胞株である KB、 Sarcoma 180 は 1 0 % FCS舍有 DMEM に、 また Meth A sarcomaは 1 0 %FCS 舍有 RPMI 1640 に 1 X 1 0 4 cells の細胞密度になるように調製した。 また、 正常細胞である IMR-90については 1 0 %FCS 舍有 DMEMに 1 X 1 0 5 cells /ηώの細胞密度になるように調製した。 9 6穴 平底マイ ク口プレー ト （フアルコ ン社製、 3072) の各ゥエル に各細胞懸濁液を 50 / 1 づっ添加した。 rTCF- Πは ΚΒ、
    [0180] Sarcoma 180 および IMR- 90用には 1 0 %FCS 舍有 DMEMに、
    [0181] Meth A sarcoma用には 1 0 %FCS 舍有 RPMI 1640 に溶解、 希 釈し、 rTCF- II溶液を調製した。 それぞれの細胞慇濁液を加 えた各ゥエルに rTCF- Π溶液を 5 0 1づっ添加し、 rTCF- Π の最終濃度が 0、 2、 4、 8、 1 6、 3 1、 6 2、 125 、 250 、 500 、 1000ngZffl£になるよう に調製した。 混合後、 C02 イ ンキュベータ一中、 3 7 て、 4 日間培養した。 各細胞につ いては各ゥェル中の生細胞数のみを血球計算盤を用いて計数 し、 2面の実験値の平均値を求めた。 各細胞について rTCF- Π無添加群を対照として、 細胞障害活性 （％) を以下の計算 式により計箕し、 r TCF- Π濃度との閬係を求めた。 対照群の平均 rTCF- Π添加区
    [0182] 生細胞数 の平均生細胞数
    [0183] 細胞障害 （cells/ffl£) (cells/ )
    [0184] 活性 （％) = X100 対照群の平均生細胞数（cells/ )
    [0185] この結果、 得られた rTCF- Πの供試細胞株に対する細胞障 害活性を第 1 0図に示した。
    [0186] rTCF- Π は Sarcoma 180 や Meth A sarcomaに対して強い細 胞障害活性を、 また KB細胞に対しても細胞障害活性を有して いた。 しかしながら、 ヒ ト正常細胞である IMK-90に対しては、 全く 細胞障害活性を示さなかった。
    [0187] 2) rTCF- Πの肝細胞増殖活性
    [0188] セグ レ ンの方法（Method in cell biology Vol . 13 , p29 Academic Press, New York) こ從レ、、 ウ ィ スター系ラ ッ ト 200 gより肝実質細胞を単離した。 この肝実質細胞を 8.8 X 1 04 個/ 0. 5 ffifiZwellの濃度で、 2 4 ゥエルプレー ト （フ ァルコ ン社製） に播き、 3 7 てで培養した。 培地は 1 0 %牛 胎児血清 （ FCS)、 1 0 Mデキサメ タゾンを含むウイ リ アム ズ E (フ ローラ ボラ ト リ 一社製） 培地を使用した （以下基礎 培地と略す） 。 2 4時間培養後、 rTCF- IIを舍む基礎培地に 交換し、 更に 2 4時間の培養後3 H—チ ジ ン （アマシャム社 製） を最終濃度 4 Ci//a£になるように添加し、 次いで 2時 間培養した。 その後、 細胞を冷 PBS 、 5 %過塩素酸および 9 5 %エタ ノ ールでそれぞれ 2回洗浄した後、 風乾し、 1 O mM 塩化マグネシゥムを舍む 1 0 %SDS で可溶化し . 液体シンチ レー シ ョ ンカ ウ ンターで DNA 合成量を測定した。 rTCF - IIの 肝細胞増殖効果を第 1 1図に示した。 産業上の利用可能性
    [0189] 本発明は、 TCF- IIのア ミノ酸配列をコー ドする DNA を舍む TCF- II発現べクタ一を創製し、 これを用いて遺伝子工学的手 法によって rTCF- Dを製造するので、 TCF- Dを大量にしかも 経済的に製造することができる。 そして、 得られる rTCF- If ば、 肝細胞増殖因子等として、 医薬の分野で利用することが できる。 また、 生化学的あるいは薬理学用の試薬としても用 いりれる。
    [0190] 微生物への言及
    [0191] 1 . p c T C F ( S ) / C 1 0 6 1 / P 3
    [0192] 寄託機関
    [0193] 名 称 ： 通商産業省工業技術院微生物工業技術研
    [0194] 究所
    [0195] 住 所 ： 日本国茨城県つく ば市東 1 丁目 1番 3号 寄 託 日 ： 平成 2年 （ 1990年） 7月 13日
    [0196] 受 託 番 号 ： F E R M B P - 3 4 7 9
    [0197] I ブタぺス ト条約に基づいた寄託 ： 日本国内 寄託 （受託番号 ： FERM P-11605) より移管] 2. T C d G 2 H 3 C 2
    [0198] 寄託機関
    [0199] 名 称 通商産業省工業技術院微生物工業技術研
    [0200] 究所
    [0201] 住 所 日本国茨城県つく ば市東 1 丁目 1 番 3号 寄 託 '日 平成 3年 （1991年） 7月 10日
    [0202] ¾■ 託 番 号 F E R B P — 3 4 8 0
    权利要求:
    Claims 、 請 求 の 範 囲
    (1) TCF - D のァ ミ ノ酸配列をコ一 ドする DN A を舍むプラ ス ミ K
    (2) TCF D のア ミ ノ酸配列をコー ドする DN A が第 丄 図に示さ れる DNA である請求項 (1)に記載されるブラ ス ミ ド
    (3) 請求項 (2)に記載されるプラ ス ミ ドで形質転換された宿主 細胞
    (4) 微ェ研条菌寄第 3479号（FERM BP- 3479)である請求項 (3)に 記載される宿主細胞
    (5) 微ェ研条菌寄第 3480号（FERM BP- 3480)である請求項 (3)に 記載される宿主細胞
    (6) TCF- Πのア ミ ノ酸配列をコー ドする DNA を舍むプラス ミ ドにより形質転換した細胞を培養し、 rTCF- Πを採取する ことを特徴とする TCF- Πの生産方法。
    (7) TCF- IIのァ ミ ノ酸配列をコー ドする DNA を舍むプラス ミ ドによ り形質転換した細胞を培養し、 培養液より肝細胞増 殖因子を回収するこ とを特徵とする肝細胞増殖因子の生産 方法
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